硫酸软骨素C（CSC）被誉为“关节黄金”，在骨关节炎治疗和保健品市场拥有巨大的TAM（总可及市场）。长期以来，CSC 的工业生产依赖动物组织提取，存在能耗高、污染大、纯度低等问题，化学合成则工艺复杂、条件苛刻，生物合成因关键酶稀缺、催化性能低难以规模化。
【SynBioCon】获悉，近日，江南大学的吴静、刘立明教授等研究团队在Bioresource Technology 发表最新研究成果，通过“计算指导机制解析+物理筛选PROSS设计+模块化全细胞级联” 的技术组合拳改造软骨素 6-O- 磺基转移酶，构建高效全细胞催化体系，实现了 CSC 的高效、低成本生物合成，硫酸化率达 86.4%，效价达 12.9 g・L⁻¹，创下目前报道的最高水平。
12.9 g/L的滴度标志着该技术已正式迈过实验室概念验证阶段（TRL 3-4），向中试量产（TRL 5-6）发起冲击。
团队从数据库中筛选出6种候选酶，发现源自挪威大鼠的RnCHST3对软骨素6-位羟基具有高区域选择性。针对其可溶性表达低的问题，采用N端截短策略获得ΔN106RnCHST3变体，使转化率从4.6%提升至11.5%，但该酶对底物亲和力极弱（Km高达4.02×10³ mM），且37°C下半衰期仅8.1小时。
Figure 1. Screening and validation of chondroitin 6-sulfotransferase.
二、首次阐明酶的硫酸化区域选择性机制
通过AlphaFold2和分子动力学模拟，揭示了RnCHST3的催化机制：E59残基作为广义碱夺取质子，R38和K169稳定过渡态，遵循类SN2机制。研究发现底物结合域上方的Loop区（T300-S316）高度动态，频繁开放导致底物难以稳定结合，解释了高Km值的实验现象。
Figure 2. Catalytic mechanism of ΔN106RnCHST3.
三、机制引导的理性设计提升催化活性
基于机制解析，通过迭代饱和突变优化酶活性。双突变体M2（F210R/Y310F）硫酸化率提升至30.8%；跨区域组合的M4（M2 + A209L + A303S）进一步达40.1%；最终引入功能残基的M5（M4 + I173L）硫酸化率达46.2%，kcat/Km显著提升。
Figure 3. Improve activity of ΔN106RnCHST3 via protein engineering.
四、理性设计改造酶，活性与热稳定性双提升
为解决工程酶热稳定性不足，采用“物理筛”引导的PROSS设计，筛选出18个稳定性位点，获得变体M6（转化率59.8%）。进一步引入Q180K和N242L获得M7，37°C下半衰期延长至12.3小时（较野生型提升51.9%），硫酸化率达74.5%。
Figure 4. Improve kinetic thermostability of ΔN106RnCHST3M5 via protein engineering.
Table 1. Kinetic parameters and thermostability parameters of wild-type and mutants.
五、构建六酶级联全细胞催化体系，实现 CSC 高效合成
构建包含PAPS生物合成、ATP再生、软骨素硫酸化及PAPS再生四大模块的全细胞催化体系，将核心酶M7展示于细胞表面，克服辅因子渗透障碍。优化后硫酸化率达86.4%，CSC滴度达12.9 g·L⁻¹，为目前报道的最高水平。
Figure 5. A six-enzyme cascade whole-cell platform for CSC biosynthesis.
该研究的创新点体现在多个方面：首次鉴定并改造了新型褐家鼠软骨素 6-O - 磺基转移酶，阐明了其区域选择性催化机制；开发了机制指导结合 PROSS 的蛋白工程策略，实现酶活性与热稳定性的协同提升；构建的六酶级联全细胞催化体系，突破了 CSC 生物合成的效率瓶颈。
文章🔗：https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.134397
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