结果与讨论：
图1.该研究中采用的化学与生物催化策略
图1A 展示了传统化学合成路线：胺→酮→酯需要分步进行，通常依赖过酸或过渡金属催化剂，步骤繁琐且选择性有限。
图1B 对比了天然酶的分工：黄素依赖型胺氧化酶（AO）催化胺到酮的氧化脱氨，但会副产过氧化氢；Baeyer-Villiger单加氧酶（BVMO）催化酮到酯的氧插入，但对胺无活性。两者在进化上各自独立，无法直接串联。
图1C 呈现了该研究的设计策略：通过功能导向的祖先序列重建（ASR），整合AO与BVMO的进化信号，构建出单一活性位点内兼具两种催化功能的双功能祖先黄素酶AncFO-221，实现胺到酯的一步直接转化，避免了过氧化氢的积累问题。
图2. 具有双重AO- BVO 功能的祖先黄素氧化酶设计方案
图2 展示了双功能祖先黄素酶的设计流程，主要分为两个阶段：
第一阶段：AO功能重建。选取28个功能明确的黄素依赖型胺氧化酶序列，通过PSI-BLAST同源搜索、Clustal Ω多序列比对、IQ-TREE/RAxML系统发育重建PALM-Lazarus祖先序列推断，获得28个高置信度（bootstrap > 70%）的祖先胺氧化酶节点。
第二阶段：AO-BVO功能整合。将上述28个AO祖先节点、3个已报道的高活性祖先胺氧化酶以及160个经实验验证的BVO活性酶合并，进行第二轮祖先序列重建，构建综合性AO-BVO系统发育树。依据三项标准筛选候选节点：（i）bootstrap支持率> 70%；（ii）进化上位于AO与BVO分支的汇聚点；（iii）关键催化残基（如FAD/NADPH结合基序、AO关键组氨酸、BVO过氧阴离子稳定位点）高度保守。最终筛选出AncFO-192、AncFO-197、AncFO-219和AncFO-221四个候选节点，其中AncFO-221经表达验证后表现出最高的BVO活性（ε-己内酯占比4.01%），优化表达后被选作后续研究对象。
图3. 双功能祖先黄素氧化酶的结构、位点分析及催化循环机制
图3聚焦于AncFO-221催化机制的深入解析，综合了结构预测、分子动力学模拟和生化验证三个维度：
图3A和3B：AlphaFold3预测AncFO-221由FAD结合域、NADPH结合域和螺旋调节域三个结构域组成，整体折叠类似经典BVMO（PDB: 4RG3）。然而活性位点发生了显著重塑——经典BVMO中稳定底物的R329和T435在AncFO-221中分别被H322和C425替代，其中H322承担AO步骤的质子转移功能，C425则参与稳定FAD异咯嗪环及产物。分子动力学模拟进一步显示，底物从胺结合姿态向酮结合姿态的转变无需整体构象重排，仅依赖局部侧链调整和空腔塑性（AO阶段Cα-N5距离4.83 Å，BVO阶段d1为4.45 Å）。
图3C至3E：提出了完整的AO-BVO八步循环——AO阶段（FAD依赖）：H322拔质子后Cα-H以氢负离子形式转移至FAD N5位（限速步，能垒21.2 kcal/mol），生成亚胺并水解为酮；BVO阶段（NADPH依赖）：NADPH还原FAD，与O2生成C4a-过氧黄素，酮底物经亲核进攻形成Criegee中间体，再经O-O键断裂和基团迁移得到内酯（能垒13.9 kcal/mol）。值得注意的是，酮底物也可被酶直接还原为醇副产物（能垒仅6.2 kcal/mol），解释了初始选择性较差的原因（内酯:醇=20:80）。定点突变验证显示，H322A突变体完全丧失催化活性，而C425A则特异性阻断BVO步骤。
图4. AncFO-221的关键突变与定向进化轨迹，以及野生型酶及其突变体的反应组成分析
针对AncFO-221初始活性偏低、选择性较差（ε-己内酯与环己醇比例为20:80）的问题，作者将酶结构划分为三个独立工程模块进行逐步优化。模块A靶向FAD/NADPH结合区：对FAD结合区残基（S23、E43、S66、A427）和NADPH结合区残基（A190、A192、V340）进行定点突变，分别获得突变体M1-4和M2-3，二者组合产生的M7使ε-己内酯比例提升至39.01%。模块B重塑底物识别口袋：针对H322周围带负电簇对Criegee中间体的静电排斥，引入电荷反转突变（D321R/P323R/T324R），结合C425T对产物与FAD环的稳定作用，获得突变体M11-2，ε-己内酯比例进一步提升至58.62%。模块C消除副反应：识别出两套潜在的羰基还原催化三联体（S172-Y57-R174和S486-Y488-R489），通过Y→F和S→A突变破坏其质子供给与氢键网络，最终变体M15（M11-2/Y57F/S172A/S486A/Y488F）将ε-己内酯比例提升至73.15%、收率达88.70%，选择性优化至96:4，环己醇副产物几乎被完全消除。图4B以柱状图形式直观呈现了野生型及各关键突变体的反应产物分布与进化历程。
图5.突变体M15催化性能增强的机制分析
为阐明M15在活性和选择性上的双重优化，作者构建了六组100 ns的分子动力学模型，分别对应野生型与M15在AO阶段（CHA-FAD-NADPH）、BVO亲核进攻阶段（CYH-FADHOO-NADP⁺）及Criegee中间体稳定阶段（CRIints-NADP⁺）的构象对比。在AO阶段，M15中Cα—H向FAD N5位氢负离子转移的几何构型得到显著优化：催化距离d由野生型的4.83 Å缩短至2.81 Å，攻击角θ由111.4°调整至121.5°，接近过渡态理论值（122.10°），使AO活性构象（d ≤3.5 Å，θ∈[107°, 137°]）的占比从16.25%提升至30.69%。在BVO亲核进攻阶段，过氧黄素对环己酮羰基的亲核攻击距离d1由2.75 Å缩短至2.35 Å，β角优化至108°，活性构象占比从8.7%提升至25.4%。在Criegee中间体稳定性方面，M15中CRIints的结合自由能由野生型的-68.2 kcal/mol降至-148.5 kcal/mol，稳定性增益达80.3 kcal/mol。在副反应抑制方面，Y57F/S172A/S486A/Y488F突变通过消除酪氨酸羟基供给质子的能力并瓦解丝氨酸介导的氢键网络，阻断了羰基还原催化三联体的功能，从而几乎完全抑制了环己醇的生成。综上，M15的性能提升归因于AO构象优化、亲核进攻促进、关键中间体稳定化及副反应途径阻断四个结构-功能因素的协同作用。
图6.突变体M15的底物范围
M15能够高效转化五至八元及十二元脂环胺（1a–5a），以34.17%至92.99%的分离收率获得相应内酯（1b–5b），内酯/醇选择性均超过99:1，展现出良好的脂环底物耐受性。对于中链和长链α-脂肪胺（6a–8a），M15催化生成区域异构酯对（6b–8b与6b′–8b′），总收率为32.33%至58.06%。尤为值得注意的是，与经典Baeyer-Villiger氧化中“芳基>叔烷基>甲基”的迁移序规则相反，M15优先迁移迁移能力较弱的甲基，使异常区域异构体（6b′–8b′）成为主要产物，区域选择性高达74%至99%。这一反常迁移偏好同样适用于芳香胺（9a–10a）和酚类衍生物（11a–12a），异常异构体（9b′–12b′）占主导地位，总收率为29.39%至88.50%。对于含有茚满骨架的空间位阻底物13a，M15仍能以59.33%的总收率获得相应酯产物，异常异构体13b′占85%。除胺底物外，M15还催化复杂唑类硫醚（14a–15a）的S-氧化反应，以71.05%和42.12%的收率得到亚砜产物14b和15b，且未检出副产物。总体而言，M15兼具广泛的底物适应性和可编程的反常区域选择性，其“弱迁移基团优先”的偏好与经典BVMO的电子效应主导规律形成鲜明对比，为区域异构体的选择性合成提供了互补性生物催化平台。
图7.底物6c（2-庚酮）在M15活性位点中所形成关键Criegee中间体的二面角分布
作者以2-庚酮（6c）为模型底物，追踪了其Criegee中间体在M15活性位点内100 ns模拟过程中两套关键二面角的演化轨迹：正常二面角（∠O(peroxy1)─O(peroxy2)─
C(carbonyl)─C(pentyl),，对应于戊基迁移生成正常酯产物）和异常二面角（∠O(peroxy1)─O(peroxy2)─C(carbonyl)─C(methyl)，对应于甲基迁移生成异常酯产物）。模拟结果表明，异常二面角在模拟后期持续稳定于±180°附近（即150°至180°及-180°至-150°区间），而正常二面角则呈现大幅波动且远离迁移允许构象。这一差异直接表明：M15活性口袋的几何约束迫使Criegee中间体优先采取甲基与过氧键处于反式共平面的构象，从而引导迁移能力较弱的甲基优先迁移。其余底物7c–13c的Criegee中间体二面角分布均呈现一致趋势，进一步证实了该反常区域选择性是M15活性位点结构的普遍性内在属性，而非特定底物的偶然现象。
结论：
该研究首次使用功能导向的祖先序列重建技术将传统的单功能酶优化拓展至双功能酶体系，为整合进化上长期隔离的催化模块提供了可推广的计算框架。在催化机制层面，研究突破了黄素酶家族功能分工的既有认知，通过多尺度计算与实验验证，揭示了单一活性位点如何依赖局部构象可塑性而非整体结构重排来有序容纳胺氧化与Baeyer-Villiger氧化两种化学性质迥异的反应，丰富了我们对黄素酶催化多功能性的理解。在实际应用层面，M15变体以96:4的选择性和92.99%的分离收率实现了环己胺到ε-己内酯的直接转化，同时展现出颠覆经典迁移规则的区域选择性——优先迁移弱迁移性基团，为内酯、酯及亚砜类精细化学品和药物中间体的合成提供了温和、高效且可编程的生物催化平台，也为构建多步氧化级联反应、简化工艺配置和降低过氧化氢管理成本提供了新的思路。
原文网址：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.aef2491
Wu Y, Song W, Wei W, et al. A programmable bifunctional flavoenzyme for direct amine-to-ester conversion. Science Advances, 2026, 12(25): eaef2491.
