[科研进展]2024级硕士研究生周佳佳：不用ATP也能跑通的PLP(5′-磷酸吡哆醛)的全细胞一锅法催化路线

PLP（pyridoxal 5′-phosphate，5′-磷酸吡哆醛）是维生素 B6 的催化活性形式，也是细胞代谢和酶促合成中功能最多样的有机辅因子之一。它参与转氨、脱羧、消去、取代与碳-碳键形成等一大类 PLP 依赖性反应，因而在手性胺、非天然氨基酸和医药中间体的酶法合成中扮演关键角色。

工业上的 PLP 主要由吡哆醇（PN）经化学合成：先 C4′-氧化、再醛基保护、然后 C5′-磷酸化、最后脱保护。论文开篇就把这条老路的代价摆得很清楚——C4′-氧化用 MnO₂ 这类重金属氧化剂，原子经济性差并带来含锰废水；C5′-磷酸化在强酸条件下用多聚磷酸，区域选择性差、产生难分离的同分异构副产物；中间的保护-脱保护步骤进一步抬高物料与能耗。整条化学路线最终的原子经济性只有 38%。

生物路线分两条。一是从头生物合成，从可再生碳源一路构建 PLP，但通量被代谢竞争与严格的 PLP 稳态机制卡住，目前仍停留在概念验证阶段，滴度只有 1.58 g/L、生产强度 0.06 g/L·h。二是基于 PN 的生物催化转化：先用激酶把 PN 磷酸化为 PNP，再用氧化酶把 PNP 氧化为 PLP。其中，ATP 依赖路线用沙门氏菌的 SePdxK3 磷酸化、酵母 ScPdxH32-3E 氧化，再加上 Cytophaga hutchinsonii 的 ChPpk2 做 ATP 再生、结核分枝杆菌的 MtCAT 分解 H₂O₂，配合做两菌两步可以得到 21.3 g/L，但 ATP 再生系统与多步操作让流程非常复杂。课题组前期用沙门氏菌酸性磷酸酶突变体 StAPase^M7 + E. coli EcPNPO 走 ATP 非依赖路线（PPi 当磷酰基供体），同样两菌两步，滴度只有 14.5 g/L、生产强度 0.97 g/L·h；中间体 PNP 与产物 PLP 还容易在胞内被磷酸酶水解成 PN 和 PL，既损失产物、又损失碳。

论文把这三件事同时解决：把"磷酸化 + 氧化 + H₂O₂ 解毒"三个酶装进同一株 E. coli，把催化模块与磷酸酶在空间上分开，再用翻译调谐拉高通量并敲掉残余磷酸酶。最终得到的 JJZ 9.1 在 5 L 反应器（2 L 工作体积）中跑 16 h，得到 69.8 g/L PLP，生产强度 4.36 g/L·h，相较前期 ATP-非依赖双菌法在滴度上拉高了约 4.8 倍、在生产强度上拉高了约 4.5 倍。

一、把三个酶拉进同一株细胞

第一步是在 E. coli BL21(DE3) 中共表达 StAPase^M7、EcPNPO 与藤黄微球菌过氧化氢酶 MlCAT。三种酶分别放在不同拷贝数的质粒上——活性较弱的 StAPase^M7 用高拷贝（pRSF-Duet-1、pET-28a），活性较强的 EcPNPO 与 MlCAT 用低拷贝（pET-Duet-1、pCDF-Duet-1、pACYC-Duet-1）。在诱导条件（37 °C 培养到 OD₆₀₀ 0.6，0.3 mM IPTG，16 °C 表达 14 h）与转化条件（pH 5.5，20 °C，200 rpm）系统优化后，12 株工程菌中表现最好的 E. coli 02 摇瓶滴度从 1.5 g/L 提到 7.0 g/L，但体系里仍残留 0.34 g/L PNP、10.2 g/L PL 和 25.3 g/L 未反应的 PN·HCl——前体没吃完、产物在被反向水解、副产物没压住。

体外验证同步完成。HPLC 上 PN 标准、PN 加 PN 标准、反应样品、PN-缺失对照、Spike 加标样品的色谱与飞行时间质谱二级谱都一致——前体离子 m/z 246.1、特征子离子 m/z 228.1（−H₂O）、218.1（−CO）、97.0（H₂PO₄⁻）、79.0（PO₃⁻），PN-缺失对照无对应信号。这一步先在体外把"StAPase^M7 + EcPNPO + MlCAT"三级联彻底证伪。

图 1 | 三酶级联系统的构建与体外/体内验证：a 通路示意（PN → PNP → PLP 与 H₂O₂ 解毒）；b 体外 HPLC + TOF-MS/MS 表征；c 12 株工程菌的摇瓶 PLP 滴度比较，最优菌株 E. coli 02 兼具高 PLP 与低副产物

二、用空间邻近压 H₂O₂

EcPNPO 在把 PNP 氧化成 PLP 的同时把 O₂ 还原成 H₂O₂，会带来氧化胁迫并损伤酶稳定性。光靠添加 MlCAT 共表达是不够的——H₂O₂ 在胞质里扩散到哪都可能造成氧化损伤。

团队随后做了"空间底物通道（proximity channeling）"手术：把 EcPNPO 的 C 端与 MlCAT 的 N 端用不同构象的肽连接——柔性（GGGGS_n）、刚性（EAAAAK_n）、刚柔混合（EAAAAK/GGGGDS）与半刚性（AP）₆——一共 15 株变体。

四类连接肽差异很大，但唯一胜出的是半刚性 (AP)₆：E. coli 02d-3 摇瓶 PLP 从 7.0 g/L 提到 8.5 g/L（+21.4%），PNP 从 0.34 g/L 降到 0.15 g/L，PL 从 10.2 g/L 降到 7.8 g/L。结构建模显示融合未对两个酶结构域造成可见扰动。

图 2 | EcPNPO-MlCAT 融合蛋白的 linker 筛选：a 融合蛋白空间构象示意；b 15 株变体的摇瓶 PLP 与 PNP 滴度对比，半刚性 (AP)₆ 显著胜出

三、把融合蛋白"发配"到周质

副产物 PL（吡哆醛）的来源不是 H₂O₂，而是胞质里同样用 PPi 的 StAPase^M7 反过来水解 PLP。把磷酸化酶与氧化酶关在同一个胞质区里注定要打一架。

团队选了一条"空间区隔"路线：把 EcPNPO-MlCAT 融合蛋白分泌到周质（periplasm），让 StAPase^M7 留在胞质（cytoplasm）——新生 PLP 不再立即与磷酸酶相遇。

他们先在 12 个来自 Sec、SRP、TAT、Sec-TAT 复合路径的信号肽里筛选，Sec 路径上的 MalE 给出最高的 10.2 g/L（+20%）、PL 降到 7.0 g/L。

然后是对 MalE 自身的"分子外科"——按 N 区、H 区、C 区三段逐位点突变：

• N 区：     I3K     （+1 个正电荷）→ 11.0 g/L、PL 5.2 g/L
• N 区：     I3K/T5K     （再 +1）→ 11.8 g/L、PL 5.0 g/L
• H 区：     G6L     （增强疏水性）→ 12.5 g/L、PL 4.8 g/L
• H 区：     R8I     （疏水残基替换）→ 13.2 g/L、PL 4.5 g/L
• C 区：     S13L     （切割位点附近）→ 13.5 g/L、PL 4.2 g/L
• C 区：     Δ18-20     （切割区末端截短）→     14.5 g/L、PL 3.5 g/L

这就是 MalE^M6 变体所在的 JJZ 1.0：在 MalE^WT → MalE^M6 的标准化对照里，PLP 从 10.2 ± 0.4 g/L 提到 14.5 ± 0.5 g/L，PL 从 7.4 ± 0.5 g/L 降到 3.5 ± 0.4 g/L；考马斯亮蓝染色显示目标位置的总蛋白条带强度基本不变，提示滴度提升来自空间定位的优化而非表达量的简单放大。

图 3 | 信号肽工程：a 周质-胞质空间区隔的策略示意；b 12 个候选信号肽筛选，MalE 显著胜出；c MalE N/H/C 三区逐步工程化，MalE^M6（Δ18-20）实现 PLP 与 PL 的最优组合

四、用翻译调谐换底物转化率

JJZ 1.0 在 0.5 M PN·HCl（102.8 g/L）底物下摇瓶只得到 29.7 g/L PLP，残留 78.1 g/L PN·HCl，5 L 罐放大后是 37.1 g/L PLP、71.0 g/L PN·HCl。底物没吃完——这是新的瓶颈。

团队把注意力从空间层转回通量层。前期已经在高拷贝质粒 pET-28a(+) 上反复插入 StAPase^M7、用 5 个 RBS 调谐表达强度，5 株中表现最好的 JJZ 2.3 摇瓶 36.4 g/L、5 L 罐 50.2 g/L——但继续往 pET-28a(+) 上叠加拷贝数（JJZ 3.1–3.5）反而没有提升，论文给出的解释是"代谢负担（metabolic burden）"：维持过量质粒占用了过多细胞资源，限制了 StAPase^M7 继续放大的边际收益。

于是换路：改用低拷贝 pACYC-Duet-1，并通过较弱的 RBS 调低 EcPNPO-MlCAT 的竞争性表达。JJZ 3.17 摇瓶 42.3 g/L、5 L 罐 60.2 g/L。再利用 pACYC-Duet-1 的双克隆位点二次插入 StAPase^M7（JJZ 4.1：5 L 罐 67.4 g/L）→ RBS 进一步调谐（JJZ 5.2：5 L 罐 68.9 g/L）→ 不再增加拷贝数，转而优化 RBS1-ATG 间隔（JJZ 7.1：摇瓶 69.8 g/L、5 L 罐 69.2 g/L）。

最后一次手术是敲除内源磷酸酶 yigL——它一直被认为是 PLP/PNP 的"内鬼"。然而 JJZ 9.1（ΔyigL）摇瓶 70.1 g/L、5 L 罐 69.8 g/L，相对于 JJZ 7.1 的提升只有 0.4%。论文因此把这条改造定位为"贡献有限但保留"。同样的判断也写在了数据里：JJZ 9.2（把 yigL 的 ATG 换成弱翻译 GTG）摇瓶看似持平（69.0 g/L），但 5 L 罐反而掉到 48.5 g/L、OD₆₀₀ 跌到 26.0——全基因敲除带来的背景扰动在 5 L 罐上比摇瓶明显得多，这也是 JJZ 9.1 没有再做激进的二次编辑的原因。

图 4 | 系统工程与 5 L 罐放大：a JJZ 1.0 → 9.1 的菌株构建路线图（滴度与摩尔转化率）；b 各阶段工程菌的摇瓶 PLP/PL/PN·HCl 滴度对比；c 5 L 反应器（2 L 工作体积）16 h 培养的体积酶活、OD₆₀₀、PLP 滴度与转化率

五、绿色化学指标

论文在 2.4 节给出了一份基于 69.8 g/L 滴度的初步物料成本核算，按原料单价、用量与湿菌体制备成本核算，生产 1 吨 PLP 的直接原辅料成本约 USD 8 069——其中焦磷酸钠（Na₄P₂O₇·10H₂O，33.2%）、湿菌体（24.8%）、PN·HCl（23.0%）、FMN（18.7%）是四项主要构成。论文同时明确，这一估算不包含水电、人工、设备折旧、产品分离与废物处理，是反应阶段的下界。

论文 Table 2 把不同 PLP 生产路线放在同一组化学计量指标下对比：

几个对比读起来很清楚：相对前一条 ATP 非依赖双菌路线，AEf 从 21% 翻到 40%、CE 从 29% 翻到 57%、PLP 滴度从 14.5 g/L 升到 69.8 g/L——把"磷酸化 + 氧化 + H₂O₂ 解毒"放进同一株细胞这一步，几乎吃掉了双菌路线里所有"中间体处理"环节的损失。

六、结语：协同的层级

回头看这个工作的"层级"——反应兼容性（融合酶让 H₂O₂ 不再走远）、空间区隔（信号肽把氧化模块隔到周质，避开胞质磷酸酶）、翻译调谐（RBS 与拷贝数让磷酸化模块放够量而不把细胞压垮）、内源副反应（YigL 的有限贡献被如实写出）、工艺级整合（单菌一锅把双菌双步的所有中间环节吃进去）。每一层都对应一种明确的物理或分子障碍，每一层都有可控的设计变量（连接肽、信号肽、RBS 强度、拷贝数、靶基因）。

这也许是它对其他多酶全细胞级联最有借鉴意义的地方：当反应本身复杂（中间体易水解、辅因子依赖、H₂O₂ 反馈），单点改造往往事倍功半；把它拆成"反应-空间-通量-副反应-工艺"五层，逐层定位瓶颈、逐层给工具，再在 5 L 罐上做整合验证——这套工程节奏，可以平移到任何一个"小分子辅因子 + 多酶 + 胞内副反应"的体系。

参考资料

Zhou, J., Song, W., Li, X., Hu, G., Gao, C., Liu, J., Zhang, Y., Zhou, Y., Wu, J., Liu, L., & Wei, W. (2026). ATP-free single-strain one-pot whole-cell bioconversion of pyridoxal 5'-phosphate from pyridoxine. Green Chemistry. DOI: 10.1039/d6gc03538h

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