💡核心亮点 通过构建基因组规模代谢模型（GSMM），精准定位并弱化脱羧碳泄漏节点，耦合CO₂固定通路、基因组精简及工业残糖利用模块，在大肠杆菌中实现L-苏氨酸产量与碳原子经济性的双跃升，1000升发酵罐中糖酸转化率达0.68 g/g。
Fig. 1. Schematic illustrating engineering of L-threonine high-yielding strain.
🔬 背景介绍
L-苏氨酸是饲料、食品和医药领域的关键必需氨基酸，预计2025年全球微生物发酵总产量将达70万吨。大肠杆菌利用葡萄糖合成L-苏氨酸的理论转化率为0.81 g/g，但目前工业实际得率大多停留在0.62 g/g左右。 造成这一理论与实际差距的核心痛点有二：第一，在中心代谢和氨基酸合成途径中，大量碳原子以CO₂形式流失，这种“脱羧碳逃逸”常被传统代谢工程忽视；第二，工业葡萄糖原料中通常含有约3%的麦芽糖、蔗糖等非葡萄糖糖类，常规生产菌株无法高效利用这些组分，导致底物浪费和转化率折损。
🧬 核心技术深度解析
1. Identification of CO₂ escape nodes during L-threonine biosynthesis based on a genome-scale metabolic model
为系统定位碳流失节点，研究团队首先对工业L-苏氨酸生产菌株Thr1进行全基因组测序，构建了包含2239个反应和1061个基因的菌株特异性基因组规模代谢模型（GSMM-iJHL1061）。通量平衡分析（FBA）预测，每合成1 mol L-苏氨酸会释放0.89 mol CO₂。如图1所示的代谢网络全局图中，团队明确了涉及主合成路径和分支路径的多个脱羧反应节点。随后，通过转录组学结合发酵尾气分析，锁定了14个关键候选基因。如图2B的数据对比，采用CRISPRi技术对这14个靶点进行逐一抑制测试发现，弱化gnd、ilvBN和lysA可将L-苏氨酸产量提升6.66%-7.54%；而抑制TCA循环核心基因（sucA、icd、aceE）则导致严重的生长受损（图2A）。
Fig. 2. Shake-flask evaluation of key CO2-related targets during L-threonine biosynthesis.
2. Attenuating CO₂ escape and enhancing CO₂ fixation during L-threonine biosynthesis
在锁定靶点后，团队开展了层层递进的代谢重塑：弱化竞争与脱羧：使用弱启动子替换 ilvBN、lysA 和 gnd 的天然启动子，有效降低了CO₂释放量。但如图3D所示，gnd 的弱化导致胞内NADPH水平下降6.27%。为此，团队引入了谷氨酸棒杆菌的 ppnK 并增加 pntAB 拷贝数，成功恢复了辅酶平衡（Thr4菌株）。重塑氮同化与TCA循环：采用生长偶联启动子动态抑制 icd，限制TCA循环的过量碳耗。针对由此引发的谷氨酸（前体）供应不足，团队切断了原有的谷氨酸依赖型氨基转移（敲除 aspC），转而引入铵转运蛋白 amtB 和外源天冬氨酸脱氢酶 aspDH，建立直接的NH₄⁺同化途径。图3C和3F表明，该策略（Thr6菌株）使累积CO₂排放量大幅降低37.65%，NH₄⁺消耗显著增加。
Fig. 3. Reduction of CO2 emission during L-threonine biosynthesis.
引入CO₂固定模块：为回收逃逸的碳原子，引入了RuBisCO分流途径（prk-cbbm）和碳酸酐酶-丙酮酸羧化酶模块（cynT-pyc）。图4F证实胞内天冬氨酸（关键前体）池提升了21.16%。结合¹³C同位素示踪分析（图5），M+1、M+2及M+3同位素广泛存在于草酰乙酸、高丝氨酸和L-苏氨酸中，直接证明外源CO₂被成功固定并导入产物合成路径。
Fig. 4. Enhancement of CO2 fixation during L-threonine biosynthesis.
3. Genome reduction of strain Thr8 to reduce growth-associated carbon consumption
细胞生长本身的维持能耗是另一大碳汇。团队通过比较基因组学和必需基因分析，系统删除了Thr8菌株中包含移动遗传元件、鞭毛合成基因及冗余膜蛋白在内的166个非必需基因（总计约135 kb，占基因组2.9%）。 图6A和6B的生长的发酵动力学曲线显示，精简后的Thr9菌株发酵周期缩短了2小时，最大OD₆₀₀下降1.78%，且累积CO₂排放量进一步降低3.50%。碳资源实现了从非生产性消耗向目标产物合成的有效重定向。
Fig. 5. Effect of introducing CO2 fixation pathways on L-threonine biosynthesis with NaH13CO3 supplementation.
4. Enhancing maltose and sucrose utilization of industrial glucose feedstocks
针对工业葡萄糖和甜菜糖蜜中的残糖问题，团队敲除了大肠杆菌中的PTS系统负调控因子 mlc 以解除碳分解代谢阻遏，并在该位点引入了麦芽糖水解基因（glvAC）。同时，在yacH位点整合了蔗糖利用操纵子（scrKYABR），获得最终菌株Thr10。 在图6E展示的1000升中试发酵结果中，Thr10菌株在工业淀粉水解液中发酵28小时，最终效价达到132.5 g/L，得率0.68 g/g。图6F的数据显示，发酵终点未检测到麦芽糖和蔗糖积累，证明工业底物被充分同化。
Fig. 6. Genome streamlining and improved residual sugar utilization enhance L-threonine production and support pilot-scale fermentation.
🏭 产业化前景与商业价值评估
中试验证完成：在1000L工业罐中复现了0.68 g/g的高转化率和4.73 g/L/h的生产强度，排除了实验室到中试常见的规模化效应干扰。
成本优势明确：大宗氨基酸属于典型的成本敏感型产品。通过利用原本废弃的约3%的残糖（麦芽糖、蔗糖），将得率逼近理论极限，这对万吨级生产线意味着每年数百万至千万级的原料成本节省。
低碳制造契合：通过耦合双路CO₂固定模块，直接减少了发酵过程的碳排放，符合当前生物制造的低碳战略要求，有助于企业在未来的碳足迹核算和ESG评级中建立护城河。
🚀 局限性与未来展望
未知的可溶性代谢物泄漏、溶氧等参数对发酵后期的影响仍需定量分析。全基因组重测序发现的驯化突变位点需要通过反向工程进行确证。需进一步精确调控TCA循环在不同发酵阶段的通量，以降低动态代谢失衡风险。探索农林废弃物、C1平台化合物等更低成本的原料底盘适配性，从根本上降低大宗氨基酸的生产底本。
🏷️关键词： #L-苏氨酸 (L-Threonine) | #基因组规模代谢模型 (GSMM) | #CO₂固定 (CO₂ Fixation) | #基因组精简 (Genome Streamlining) | #工业底物利用 (Industrial Feedstock)
📚参考文献 Liu, J., Sheng, Q., Ye, C., Dong, X., Meng, G., Zhao, C., Wei, A., Yang, F., Liu, J., Liu, L., Carbon-loss-guided metabolic engineering improved carbon atom economy and industrial feedstock utilization for l-threonine fermentation, Bioresource Technology (2026), doi: https://doi.org/10.1016/j.biortech.2026.136083
