摘要
丙酮酸连接中心碳代谢与多种高价值化学品的合成，但其供给受到天然糖酵解调控、代谢分流以及生长与生产竞争的共同限制。江南大学研究团队在大肠杆菌中重构古菌非磷酸化 Entner–Doudoroff（npED）通路，结合关键酶改造、甘油醛碳回收和群体感应动态调控，协调天然 EMP 糖酵解与异源 npED 通路的分阶段运行。在 5 L 生物反应器中，优化菌株 40 h 生产丙酮酸 98.15 g/L；进一步连接下游合成模块后，L-丙氨酸和 L-缬氨酸滴度分别达到 164.28 g/L 和 102.32 g/L。
论文信息
原文标题：Programmed switching between native glycolysis and a non-phosphorylative pathway enables pyruvate-derived biochemicals
期刊：Chemical Engineering Journal
接收日期：2026-10-29
第一作者：黄文潇
通讯作者：刘立明、刘开放
参与机构：江南大学生物工程学院、工业生物技术教育部重点实验室；江南大学生命科学与健康工程学院
01 天然糖酵解为什么需要一条补充路线？
丙酮酸既是细胞维持生长和能量代谢的重要节点，也是 L-丙氨酸、L-缬氨酸等产物的合成前体。增加它的供给，并不只是把某个酶表达得更多：葡萄糖进入天然 Embden–Meyerhof–Parnas（EMP）通路后，还要经过多个反应和分支，中间体同时承担生物量、还原力及其他前体的供给任务。
因此，研究团队关注两个相互关联的问题：能否增加一条较短的葡萄糖到丙酮酸供给路线？这条路线又应当在什么时候增强，才能兼顾细胞生长与产物积累？
研究选择的是古菌中已知的 npED 反应模块。葡萄糖先由葡萄糖脱氢酶（GDH）氧化为葡萄糖酸，再由葡萄糖酸脱水酶（GAD）生成 2-酮-3-脱氧葡萄糖酸（KDG），最后由 KDG 醛缩酶（KDGA）裂解。这三步的直接产物是一分子丙酮酸和一分子甘油醛。核心反应不需要糖磷酸化，但要充分利用葡萄糖的全部碳，仍需连接甘油醛回收支路。
团队比较候选古菌酶后，选择 S. solfataricus 来源的 GDH、GAD 与 P. torridus 来源的 KDGA。在体外一锅级联中，12 h 后检测到 1.62 ± 0.05 mM 丙酮酸和 1.58 ± 0.04 mM 甘油醛，测得代谢物的碳回收率为 99.3 ± 0.5%；同时观察到 NADH 生成。这些结果验证了所选三酶组合的功能。
图 1｜核心 npED 模块的选择与体外重构。a，三步反应及产物；b，候选酶活性比较；c，级联反应终点代谢物；d，NADH 生成过程。
02 通路能运行，还要处理副产物与碳源入口
为了验证模块在细胞内能否供给丙酮酸，作者先构建生长依赖丙酮酸供应的验证菌株。该菌株在以葡萄糖为唯一碳源的基本培养基中几乎不能生长；引入 npED 模块后，生长得到恢复，说明这条异源路线能够在大肠杆菌中发挥作用。
生产菌株的改造则从减少丙酮酸流向乳酸、甲酸、乙酸和乙醇等支路开始。接入 npED 模块后，研究者检测到 1.73 g/L 甘油醛积累。为减少这一副产物并回收其碳，引入甘油醛脱氢酶，将甘油醛氧化为甘油酸，再连接回中心代谢。随后，团队调整葡萄糖利用方式，删除葡萄糖激酶基因 glk，并引入运动发酵单胞菌来源的葡萄糖易化转运蛋白 Glf，增强非 PTS 葡萄糖输入。
经上述改造得到的 HW12，在摇瓶中生产丙酮酸 12.98 g/L；在 5 L 补料分批发酵中达到 80.69 g/L，表观葡萄糖收率为 0.67 g/g，体积生产强度为 2.02 g/L/h。相比基础产丙酮酸菌株 HW04，产物滴度提高，但最大 OD600 降低 15.93%。这说明新路线增加了丙酮酸供给，也伴随生长代价。
进一步检测发现，HW12 中存在 KDG 积累，而 KDGA 的催化周转数和催化效率低于上游两种酶。作者据此将 KDGA 确定为后续优化的关键瓶颈。
图 2｜大肠杆菌中 npED 通路的构建与优化。a、b，生产底盘与生长耦联验证；c，菌株构建过程中的滴度和生物量；d、e，甘油醛积累及回收；f，葡萄糖输入改造；g–i，5 L 发酵中的丙酮酸滴度、比生产速率和生物量。
03 用丙酮酸传感器筛选更高效的 KDGA
直接逐个测量突变体的产物浓度，难以支撑较高通量的酶筛选。团队利用丙酮酸响应转录因子 PdhR，将丙酮酸形成转化为 eGFP 荧光输出，并用 mKate 作为内参，降低细胞状态和表达差异对读数的影响。优化后的传感器在 0–5 g/L 外源丙酮酸范围内，荧光动态范围达到 7.52 倍。
这个筛选体系还需要能区分 KDGA 活性。作者比较了缺少 kdgA 与具有不同 kdgA 表达水平的菌株：KDG 本身产生的背景响应很低，而 KDGA 表达增强后，加入 KDG 能带来更强的荧光输出。因此，KDG 裂解形成的丙酮酸可以作为筛选读数。
结合底物对接、活性口袋周围残基和序列保守性分析，团队选择 15 个位点进行饱和突变，筛得 S44T、T45N 和 S161A 三个有益突变。组合形成的三突变体 KDGA*，使摇瓶丙酮酸滴度达到 17.64 g/L，较使用野生型 KDGA 的 HW12 提高 35.90%；论文报告其催化效率提高 40.90%。
动力学结果显示，KDGA* 的最大反应速率提高，表观 Km 从 1.24 mM 降至 1.05 mM。分子动力学模拟进一步提示，变化主要发生在活性口袋的局部柔性、氢键网络及残基相互作用，而非整体酶架构的大幅改变；这些计算结果为底物结合和催化相关构象更加稳定提供了解释。
不过，将 KDGA* 整合进生产菌株得到 HW25 后，虽然 5 L 发酵滴度提高到 87.52 g/L，生长受损和后期比生产速率下降仍然存在。提高单酶能力之后，生长与生产之间的时间协调成为下一步重点。
图 3｜丙酮酸生物传感器辅助 KDGA 改造。a–d，传感器设计、归一化与表达调节；e–g，KDGA 活性的荧光报告与分辨能力；h，候选突变位点；i，单点及组合突变对丙酮酸生产和生长的影响。
04 群体感应让两条路线按生长阶段切换
通量平衡分析提示，持续强制提高 npED 通量会降低预测的最大生长速率。早期代谢物检测也显示，持续运行 npED 的 HW25 中，多种 EMP 中间体水平下降。基于这些结果，作者构建了群体感应介导的双通路动态切换系统 QS-DPS。
该系统由 EsaI 生成信号分子 3OC6-HSL，EsaR 读取信号，并通过双向启动子 PesaS/PesaR 输出相反的调控。细胞密度较低时，EsaR 与 DNA 结合，生长相关输出较强、npED 相关输出较低；随着信号积累，EsaR 脱离结合位点，生长相关输出减弱、npED 相关输出增强。图示中，生长相关一侧连接葡萄糖 PTS 转运基因 ptsG，生产相关一侧连接 gdh–gad–kdgA。
切换的时间取决于信号生成与响应阈值的匹配。EsaI 表达过弱时，信号不足以触发生产状态；表达过强则容易过早切换。经过启动子和核糖体结合位点调节，研究者获得了能够先维持生长、再增强生产的双输出行为。
动态调控菌株 HW26 在 5 L 发酵中，于约 8–10 h 出现两侧启动子活性的明显反向变化；转录和代谢物分析也支持由 EMP 相关生长状态向 npED 相关生产状态转变。最终，HW26 在 40 h 生产丙酮酸 98.15 g/L，表观葡萄糖收率为 0.73 g/g，体积生产强度为 2.45 g/L/h。与 HW25 相比，其最大 OD600 提高 28.11%。
短脉冲 13C 示踪进一步支持生产状态下碳流向 npED 及甘油醛回收支路转移。在作者对三条主要丙酮酸形成支路进行的简化归一化中，npED 直接裂解与甘油醛回收合计约占 79%。这一比例是特定示踪条件和模型下的表观估计，不能直接等同于整个发酵过程的绝对碳流分配。
图 4｜群体感应介导的 EMP/npED 双通路动态切换。a，低、高细胞密度下的调控逻辑；b、c，EsaR 表达量调节及其对信号的响应；d，双报告系统；e、f，两侧启动子的响应曲线；g，调节 EsaI 表达后出现的时间依赖双输出切换。
05 连接下游模块：从丙酮酸到两种氨基酸
团队用单步转化的 L-丙氨酸和多步合成的 L-缬氨酸，检验底盘对不同下游路线的支持能力。
L-丙氨酸路线引入枯草芽孢杆菌丙氨酸脱氢酶，并通过减少消旋副产物、增强产物输出改善生产。最终菌株 Ala03 在 5 L、40 h 补料分批发酵中生产 L-丙氨酸 164.28 g/L，表观葡萄糖收率 0.92 g/g，体积生产强度 4.11 g/L/h。其滴度较无 npED 对照 Ala04 提高 27.90%，较持续运行 npED 的 Ala05 提高 17.85%。
L-缬氨酸路线则结合乙酰乳酸合成步骤优化、IlvC 辅因子偏好调整，以及 NADH 依赖的末端还原胺化，使下游还原力需求更好地与底盘匹配。最终菌株 Val03 生产 L-缬氨酸 102.32 g/L，表观葡萄糖收率 0.53 g/g，体积生产强度 2.56 g/L/h，滴度较无 npED 对照和持续运行 npED 的对照分别提高约 30.2% 和 15.2%。
三种产品采用了不同的供氧策略：丙酮酸使用好氧发酵，L-丙氨酸使用先好氧、后厌氧的两阶段策略，L-缬氨酸采用限氧生产。由于培养基还含有玉米浆粉和酵母提取物，上述 g/g 数值均是按葡萄糖消耗计算的表观收率。
图 5｜动态切换底盘用于 L-丙氨酸和 L-缬氨酸生产。a、b，两种产物的合成与改造路线；c–e，L-丙氨酸生产菌株的生物量、滴度及比生产速率；f–h，L-缬氨酸生产菌株的对应比较。
06 讨论与展望
作者将这项工作的重点放在已知 npED 模块的工程化整合：通过甘油醛碳回收、非 PTS 葡萄糖输入、瓶颈酶优化，以及依赖细胞密度的自主调控，使较短的前体供给路线与宿主生长需求相协调。酶改造增加通路能力，动态调控则决定这种能力在什么阶段释放。
在未来方向上，作者提出将该底盘与 TCA 循环、磷酸戊糖途径、乙酰辅酶 A 代谢及芳香族氨基酸前体网络连接，探索更多有机酸、氨基酸及其他化学品的合成；同时考虑向谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母等工业宿主迁移。跨宿主适配、系统层面的通量分析和动态元件优化，仍需要进一步验证。
参考文献
[1] Huang W, Zhang L, Zhang X, Liu J, Gao C, Liu K, Liu L. Programmed switching between native glycolysis and a non-phosphorylative pathway enables pyruvate-derived biochemicals. Chemical Engineering Journal, 2026, 183709.
